Quá trình định danh và mô tả đặc điểm của dòng vi khuẩn B. polyfermenticus KJS-2 đã được thực hiện sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, bộ kit chuẩn API 50CHB, phân tích trình tự gen 16S rDNA, cây phát sinh loài, thử nghiệm catalase và oxidase.

Tỷ lệ chuyển hóa glucose thành axit lactic của dòng Bacillus polyfermenticus KJS-2 (B. polyfermenticus KJS-2) được nhận thấy là 60,71 ± 4,9%. Ngoài ra, tiến hành thực nghiệm khả năng sống của dòng B. polyfermenticus KJS-2 trong dịch vị dạ dày nhân tạo (pH 2,0) và axit mật (pH = 6,5) trong 4 giờ cho kết quả cuối cùng tương ứng là 140 ± 7,9% và 108 ± 3,5 %. Cuối cùng, kết quả thực nghiệm về khả năng bám dính sử dụng tế bào biểu mô ruột Caco-2 cho thấy độ bám dính của dòng B. polyfermenticus KJS-2 vào tế bào Caco-2 là vào khoảng 65 ± 0,6 % .

Một loại men probiotic ( men tiêu hóa, men vi sinh ) tốt nên có ít nhất 5 đặc tính sau đây: (1) kích thích tăng trưởng hoặc tăng sức đề kháng với bệnh tật, (2) không độc hại và không gây bệnh, (3) ở trạng thái các tế bào sống, tốt nhất là với số lượng lớn, dù không biết được liều lượng hiệu quả tối thiểu, (4) có khả năng sống và chuyển hóa trong môi trường đường ruột, (5) ổn định và có khả năng duy trì sự sống trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản và môi trường thực tế ứng dụng. Các ứng dụng thích hợp của các loại men probiotic (men tiêu hóa, men vi sinh ) đã được đưa ra nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, từ đó dẫn đến cải thiện sự hấp thụ dinh dưỡng và giảm các vấn đề gây bệnh ở đường tiêu hóa. Men tiêu hóa cũng đã được ứng dụng cho đa dạng các loài thủy sản nuôi bao gồm cá hồi và tôm bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, các dòng Bispan khác biệt với B. subtilis bởi vì chúng có khả năng tiết ra một lượng lớn axit acetic và axit lactic tương ứng từ glucose và lactose. Các dòng Bispan từ lâu đã được sử dụng để điều trị rối loạn đường ruột mãn tính, bởi đó là các dòng vi sinh sống ở dạng nội bào tử hoạt động có thể vào tới trong ruột của người và động vật một cách thành công.

B. polyfermenticus KJS-2 là một trong số những dòng Bispan, nhưng hiện nay có rất ít thông tin về loại vi sinh vật này. Trong nghiên cứu này, B. polyfermenticus KJS-2 được phân lập từ dòng Bispan và sau đó nhận dạng bằng trình tự gen 16S rDNA, phân tích hệ thống phát sinh loài, thử nghiệm catalase và oxidase, quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM. Ngoài ra, dòng vi khuẩn này đã được đánh giá về khả năng chuyển hóa axit lactic, độ ổn định trong dịch vị dạ dày nhân tạo và axit mật, thí nghiệm in vitro về mức độ bám dính vào tế bào biểu mô ruột Caco-2. Hơn nữa, B. polyfermenticus KJS -2 đã được đánh giá phân loại sử dụng bộ kit chuẩn sinh hóa API 50CHB. Dòng sinh sản B. polyfermenticus KJS -2 KCCM10769P được duy trì ở nhiệt độ – 70^oC trong môi trường TSB, Difco chứa 20% (v/v) glycerol. Chế độ cấy được nhân giống trong môi trường TSB lắc ở nhiệt độ 37^oC. Tất cả các thuốc thử được mua từ Sigma (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Tất cả các vi sinh vật đã được lấy từ Trung tâm nuôi cấy vi sinh vật Hàn Quốc (KCCM) hoặc Bộ sưu tập chủng chuẩn của Hàn Quốc (KCTC).

Hình 1. Quan sát B. polyfermenticus KJS-2 bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM. VC, tế bào sinh dưỡng; SC, áo bào tử; ES, nội bào tử.

Kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy B. polyfermenticus KJS-2 có đặc điểm là vi khuẩn hình que với chiều dài dao động từ 0,5 đến 2 μm hình thành nội bào tử có kích thước trong khoảng 0,4 – 0,6 μm (Hình 1). Ranh giới của vỏ ngoài, vỏ bào tử, thành bào tử và áo bào tử của vi sinh vật này rõ, mịn và không vỡ. B. polyfermenticus KJS-2 được định danh là dòng mới phân lập từ dòng Bispan và gửi vào Trung tâm nuôi cấy vi sinh vật Hàn Quốc (KCCM) theo số đăng ký KCCM10769P.

Sử dụng bộ kit chuẩn API 50CHB để đánh giá các đặc điểm sinh hóa của dòng B. polyfermenticus KJS-2. Số lượng các nguồn cacbon được sử dụng bởi dòng B. polyfermenticus KJS-2 tương đối ít hơn so với các dòng B. subtilis 168 and B. polyfermenticus SCD (Bảng 2).

Bảng 2. Xác định các nguồn cacbon được sử dụng bởi dòng B. polyfermenticus KJS-2 và 2 dòng Bacillus khác bằng bộ kit chuẩn sinh hóa API 50CHB.

Việc sản sinh axit lactic được hy vọng ​​sẽ tạo ra tác dụng kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gây bệnh thông qua sự giảm pH. Do đó, B. polyfermenticus KJS-2 sản sinh axit lactic có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất polyme phân hủy sinh học với các ứng dụng trong các ngành y tế, dược phẩm và thực phẩm.

Hình 2. So sánh khả năng sống của B. polyfermenticus KJS-2 trong dịch vị dạ dày nhân tạo (pH 2,0) và axit mật nhân tạo (pH 6,5).

Stress của tế bào bắt đầu ở dạ dày có mức pH thấp 2,0. Sử dụng một hệ thống in vitro với mức pH 2,0 (Hình 2) để xác định ảnh hưởng của môi trường pH axit ở dạ dày đến khả năng sống của dòng B. polyfermenticus KJS-2. Khi tiếp xúc ở môi trường pH 2,0 thì B. polyfermenticus KJS-2 vẫn tồn tại trong 4 giờ và hàm lượng của nó tăng lên. Các kết quả này thể hiện B. polyfermenticus KJS-2 không bị tác động bất lợi bởi điều kiện axit mạnh. Sau khi các vi sinh vật đi qua dạ dày thì sẽ vào đường ruột trên, ở đó muối mật được tiết thẳng vào dạ dày. Vì vậy, cần lợi khuẩn axit lactic đề kháng với mật. Theo đó, chúng tôi đã đánh giá độ nhạy cảm của dòng B. polyfermenticus KJS-2 với mật bằng cách nuôi cấy nó ở môi trường TSB có chứa 0,3% mật (Hình 2).

Kết quả thể hiện mức B. polyfermenticus KJS-2 được duy trì khi có mật cho thấy là tương đối kháng mật. Chúng tôi đã nghiên cứu độ bám dính của B. polyfermenticus KJS-2 vào các tế bào Caco-2. Dòng tế bào biểu mô ruột Caco-2 ở người là một trong những hệ thống mô hình tốt nhất để đánh giá sự tương tác giữa các tế bào biểu mô đường ruột và vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, B. polyfermenticus KJS-2 và B. polyfermenticus SCD bám dính vào các tế bào Caco-2 tương ứng khoảng 65 ± 0,6 % và 54 ± 1,4%. B. polyfermenticus KJS-2 được sử dụng làm lợi khuẩn trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường để chống lại sự xâm chiếm của vi khuẩn gây bệnh. Do đó, khả năng của B. polyfermenticus KJS-2 để ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh được kỳ vọng hết sức đặc hiệu và tùy thuộc vào cả vi khuẩn có lợi probiotic và vi khuẩn gây bệnh.

Tóm lại, dòng B. polyfermenticus KJS-2 sản sinh axit lactic, duy trì ổn định trong dịch vị dạ dày nhân tạo và axit mật, bám dính vào các tế bào biểu mô ruột Caco-2. Xét tất cả đặc điểm này cho thấy B. polyfermenticus KJS-2 là một dòng lợi khuẩn thích hợp dùng trong công nghiệp.

Kim, Kang Min¹, Myo Jeong Kim¹, Dong Hee Kim², You Soo Park³, and Jae Seon Kang⁴

¹Khoa Dược và Thực phẩm Thông minh, Đại học Inje, Gyeongsangnam-do 621-749, Hàn Quốc

²Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển, Công ty TNHH Daewoo, Gyeongsangnam-do 621-749, Hàn Quốc

³Khoa Thí nghiệm Hóa sinh, Đại học Y Quốc gia Pusan, Busan 609-735, Hàn Quốc

⁴Khoa Dược, Đại học Kyungsung, Busan 608-736, Hàn Quốc

Ngày nhận: 5/3/2009 – Ngày chỉnh sửa: 16/3/2009 – Ngày công nhận: 23/3/2009

Phòng Nghiên cứu và Huấn luyện – CTCBIO VINA

Nguồn: Tạp chí Vi sinh học và Công nghệ Sinh học