Nghiên cứu về đồng nhiễm WSSV và Vibrio parahaemolyticus

Quay lại

Nghiên cứu về đồng nhiễm WSSV và Vibrio parahaemolyticus

: 3660

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) gây ra bởi các chủng vi khuẩn cụ thể Vibrio parahaemolyticus (VpAHPND) đã được báo cáo ở tôm nuôi tại Đông Nam Á và Châu Mỹ kể từ năm 2009. Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh bao gồm bệnh teo gan, đường tiêu hóa trống rỗng, xuất hiện màu trắng đục ở dạ dày và lờ đờ. Bệnh do vi khuẩn này đã gây ra tỷ lệ chết lên tới 100% ở các quần thể tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon) nuôi, thiệt hại kinh tế nói chung do AHPND và các bệnh tôm khác đã ước tính lên tới 23,6 tỷ USD trên toàn cầu với doanh thu thức ăn chăn nuôi mất đi thêm 7 tỷ USD.

Trong một số trường hợp, VpAHPND đã được báo cáo có đồng nhiễm với vi bào tử trùng Entferocytozoon hepatopenaei (EHP). Mặc dù EHP dường như không gây chết, nhưng động vật bị nhiễm EHP sẽ dễ bị tổn thương hơn đối với AHPND, có thể gây nhiều tôm chết trong ao nuôi. Tôm bị nhiễm EHP tăng độ mẫn cảm với VpAHPND, cho thấy tôm bị suy yếu do EHP sẽ không chống nổi các mầm bệnh thứ cấp như VpAHPND.

Trong vài năm, virút hội chứng đốm trắng (WSSV) đã lan ra toàn thế giới ở khắp Châu Á, Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Phi, Trung Đông và Úc. Trong một số trường hợp, WSSV đã được phát hiện ở động vật khỏe mạnh không có triệu chứng lâm sàng hoặc tỉ lệ chết cho thấy rằng nhiễm WSSV không nhất thiết dẫn đến tỉ lệ chết cao và sự nhiễm trùng thứ phát bởi các mầm bệnh cơ hội, như Vibrio spp. sẽ đẩy nhanh sự khởi phát của bệnh.

Năm 2017, tỷ lệ chết của tôm thẻ P. vannamei lên tới 60% đã được báo cáo ở Philippines. Tôm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng của AHPND nhưng được xác nhận bằng PCR là dương tính với cả VpAHPND và WSSV. Từ trường hợp này, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng nhiễm WSSV không có các triệu chứng lâm sàng sẽ khiến VpAHPND gây ra tỷ lệ chết nhanh hơn và cao hơn ở tôm nuôi so với tôm chỉ bị nhiễm VpAHPND đơn thuần.

Kết quả của chúng tôi đã chứng minh là tôm ban đầu phơi nhiễm với WSSV thì dễ bị nhiễm VpAHPND, nhưng khó khỏi bệnh theo kiểm tra mô bệnh học. Ngoài ra, sử dụng xét nghiệm qPCR và kiểm tra hóa mô miễn dịch [IHC; ứng dụng phổ biến nhất của phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, liên quan đến quá trình xác định chọn lọc các kháng nguyên (protein) trong các tế bào của một phần mô bằng cách sử dụng liên kết các kháng thể đặc biệt với các kháng nguyên trong các mô sinh học], chúng tôi đã xác định rằng nhiễm WSSV có thể bị tăng tốc do nhiễm VpAHPND thứ cấp. Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ nghiên cứu quốc gia Hàn Quốc (NRF) do chính phủ Hàn Quốc (MSIT) tài trợ (số tài trợ NRF-2018R1C1B5086350).

Thiết lập nghiên cứu

Tôm thẻ giống có nguồn gốc từ một trang trại nuôi tôm địa phương (tỉnh Jeju, Hàn Quốc) và được vận chuyển đến Viện Khoa học Hàng hải của Đại học Quốc gia Jeju ở Hàn Quốc. Tôm được nuôi tới trọng lượng trung bình 0,5 ± 0,05 gram trong các bể nuôi dưỡng thể tích 96 lít với nước biển nhân tạo được sục khí ở nhiệt độ từ 25 đến 28 độ C và độ mặn 30 ppt. Đối với thí nghiệm đồng nhiễm, tôm ấu niên (trung bình 0,5 gram, SL = 80) được chọn ngẫu nhiên từ các bể nuôi dưỡng và cho phân phối vào các bể thí nghiệm. Trước thí nghiệm đồng nhiễm, tôm đại diện được chọn lọc ngẫu nhiên và được xác nhận là âm tính với cả WSSV và VpAHPND bằng PCR.

Về các đàn nhiễm WSSV, tôm thẻ P. vannamei hấp hối có những đốm trắng trên lớp biểu bì được thu thập từ một trang trại nuôi tôm không nêu tên ở tỉnh Chungcheong nằm ở bờ biển phía tây của Hàn Quốc. Về các đàn nhiễm vi khuẩn VpAHPND, chủng 13-028/A3 trước đây đã được phân lập từ dạ dày của tôm thẻ hấp hối từ một trang trại ở Việt Nam và biểu hiện gan tụy hơi trắng (HP).

Để biết thông tin chi tiết về các thiết kế thử nghiệm đồng nhiễm WSSV và VpAHPND; các xét nghiệm qPCR; kiểm tra IHC của các mô mang; kiểm tra mô bệnh học của các mô gan tụy HP; và các phân tích thống kê, xin vui lòng tham khảo ấn phẩm gốc.

Hình 1: Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ P. vannamei sau cảm nhiễm với WSSV và VpAHPND (Nhóm 1: Chỉ nhiễm WSSV; Nhóm 2: Chỉ nhiễm VpAHPND; Nhóm 3: Nhiễm cả WSSV + VpAHPND; Nhóm 4: không bị cảm nhiễm). Tỷ lệ chết đã tăng đáng kể ở nhóm đồng nhiễm (Nhóm 3) so với các nhóm chỉ nhiễm đơn thuần 1 bệnh (Nhóm 1 và 2). Các chữ cái khác nhau cho thấy các khác biệt đáng kể về tỉ lệ sống vào ngày kết thúc (ngày 10) (P <0,05).

Các kết quả của chúng tôi cho thấy rằng tôm đồng nhiễm bệnh đã tăng tỉ lệ chết so với nhiễm một bệnh đơn thuần (Hình 1). Chúng tôi quan sát thấy tỷ lệ chết 0% ở Nhóm 1 (chỉ nhiễm WSSV) và tỷ lệ chết tích lũy là 50% vào ngày thứ 4 sau khi nhiễm ở Nhóm 2 (chỉ nhiễm VpAHPND). Tuy nhiên, tỷ lệ chết tăng đáng kể ở Nhóm 3 (WSSV + VpAHPND) so với các nhóm khác (p <0,05). Ở nhóm 3, tôm bắt đầu có tỷ lệ chết vào ngày thứ 2 sau khi nhiễm, và tỷ lệ chết tích lũy lên tới 75% vào ngày thứ 3 sau khi nhiễm. Trong suốt thời gian thử nghiệm 10 ngày, không có trường hợp tôm chết nào được ghi nhận ở nhóm đối chứng âm tính (Nhóm 4, không bị cảm nhiễm).

Các kết quả của chúng tôi cũng cho thấy tôm đồng nhiễm làm tăng mức độ nhiễm WSSV, được xác nhận thông qua qPCR và IHC, các mức độ nhiễm WSSV khác nhau rõ rệt giữa Nhóm 1 (chỉ nhiễm WSSV) và Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND) vào ngày kết thúc (ngày 10). Dựa trên phân tích qPCR, WSSV đã được phát hiện trên tôm ở Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND) nhưng WSSV âm tính ở tôm chỉ phơi nhiễm với WSSV (Nhóm 1). Ngoài ra, bằng cách kiểm tra IHC, sự nhuộm màu nâu trên tế bào chất màu hồng và nhân màu tím, các phản ứng biểu thị dương tính với WSSV đã được quan sát thấy ở tôm của Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND) (Hình 2D) tương tự như mẫu dương tính với WSSV đã được chuẩn bị trước đó trong nghiên cứu sơ bộ (Hình 2B). Tuy nhiên, các phản ứng dương tính với WSSV này không nhìn thấy ở tôm chỉ phơi nhiễm với WSSV (Nhóm 1; Hình 2A) và đối chứng âm tính (Nhóm 4, không bị cảm nhiễm; Hình 2C).

Đồng nhiễm bệnh làm giảm khả năng hồi phục nhiễm bệnh VpAHPND. Tất cả tôm trong thí nghiệm đã cho thấy các triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh AHPND, bao gồm cả gan tụy nhợt nhạt và đường ruột rỗng, trong vòng ba đến bốn ngày sau khi nhiễm ở Nhóm 2 (chỉ nhiễm VpAHPND) và Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND), và nhiễm VpAHPND đã được xác nhận bằng xét nghiệm qPCR và kiểm tra mô bệnh học. Từ phân tích qPCR, VpAHPND đã được phát hiện ở tôm chết thu thập từ cả Nhóm 2 (chỉ nhiễm VpAHPND) và Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND) vào ngày 3 và 4.

Bằng cách kiểm tra mô bệnh học, tôm đại diện từ cả Nhóm 2 (chỉ nhiễm VpAHPND) và Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND) cho thấy giai đoạn cuối điển hình có đặc trưng là nhiễm vi khuẩn diện rộng và làm bong tróc các tế bào biểu mô ống gan tụy ở cấp độ G3 – 4 (cấp 4 là nghiêm trọng nhất) vào ngày 3.

Hình 2: Xét nghiệm hóa mô miễn dịch (IHC) của tôm bị nhiễm virus hội chứng đốm trắng. (A) Đối chứng âm tính (Nhóm 4): không có các tế bào bị nhiễm WSSV trong mang tôm thẻ. (B) Đối chứng dương tính: Các tế bào dương tính với WSSV trong mang tôm thẻ bị nhiễm với mô WSSV bằng phương pháp cho ăn. (C) Đối chứng WSSV (Nhóm 1): không có các tế bào bị nhiễm WSSV trong mang tôm thẻ bị nhiễm WSSV bằng phương pháp ngâm. (D) Đồng nhiễm cả WSSV và VpAHPND (Nhóm 3): Các tế bào dương tính với WSSV trong mang tôm thẻ đã bị nhiễm WSSV trước và sau đó được cho cảm nhiễm với mầm bệnh thứ cấp, VpAHPND. Nhuộm tương phản hematoxylin. Thanh tỷ lệ: 40 μm.

Tuy nhiên, vào ngày kết thúc (ngày 10), một sự khác biệt đáng chú ý về mô bệnh học của gan tụy tôm sống sót đã được nhìn thấy giữa Nhóm 2 (chỉ nhiễm VpAHPND) và Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND). Các dấu hiệu mô bệnh học của tôm sống sót trong Nhóm 2 (chỉ nhiễm VpAHPND) có bề ngoài gan tụy bình thường và các chức năng bình thường của các tế bào B và R (Hình 3B), giống như đối chứng âm tính (Nhóm 4, Hình 3A). Ngược lại, tôm sống sót trong Nhóm 3 (nhiễm WSSV + VpAHPND) cho thấy các dấu hiệu mô bệnh học AHPND điển hình ở gan tụy, với nhiễm khuẩn trên diện rộng và làm bong tróc các tế bào biểu mô ống gan tụy ở mức độ nghiêm trọng G4 (Hình 3C).

Hình 3: Kiểm tra mô bệnh học bằng cách sử dụng các lát cắt mô cố định trong dung dịch Davidson’s AFA của tôm bị nhiễm VpAHPND, vào ngày kết thúc (Ngày 10). (A) Đối chứng âm tính (Nhóm 4): hình dạng bình thường của gan tụy. (B) Đối chứng AHPND (Nhóm 2): hình dạng bình thường của gan tụy với chức năng bình thường của các tế bào B và R. (C) Đồng nhiễm WSSV và VpAHPND (Nhóm 3): giai đoạn cấp tính điển hình với hoại tử tiến triển và bong tróc diện rộng các tế bào biểu mô ống gan tụy. Nhuộm hematoxylin/eosin-phloxine (H & E) Mayer-Bennett. Thanh tỷ lệ: 180 μm.

Lây nhiễm nhiều mầm bệnh (đồng nhiễm) phổ biến trong thực tiễn nuôi tôm. Một số trường hợp tôm bị nhiễm Vibrio có lây nhiễm WSSV đã được báo cáo với các loài penaeid khác nhau ở các quốc gia khác nhau. Chưa có phân tích chi tiết trước đó về các vai trò của các mầm bệnh này ở tôm đồng nhiễm WSSV và Vibrio. Ở các trang trại nuôi tôm, nhiễm WSSV mà không có các triệu chứng hoặc tỉ lệ chết có thể khiến tôm suy yếu và có thể gây ra nhiễm VpAHPND.

Chúng tôi cũng quan sát thấy sự suy giảm các enzyme chống oxy hóa và chống viêm nhiễm ở tôm đã bị nhiễm VpAHPND, tương tự như WSSV trong nghiên cứu đang tiến hành của chúng tôi và chúng tôi nghi ngờ rằng nhiễm VpAHPND cũng có thể làm tổn thương động vật, làm tăng tính nhạy cảm với các mầm bệnh khác trong ao.

Các cách tiêm cơ (IM) đã được sử dụng rộng rãi để lây nhiễm tôm thử nghiệm với WSSV. Tuy nhiên, tiêm cơ chưa được coi là con đường lây nhiễm của VpAHPND. Ngoài ra, cho ăn qua đường miệng có thể làm nhiễm cả WSSV và VpAHPND, nhưng đây không phải là phương pháp thực tế đối với các thí nghiệm nhiễm hai bệnh vì tôm thí nghiệm được cho là bị nhiễm hai lần trong các khoảng thời gian ngắn. Do đó, đối với sinh thử nghiệm hiện tại, chúng tôi đã chọn phương pháp ngâm (qua đường nước) để tôm đồng nhiễm WSSV và VpAHPND. Các tác động hiệp đồng bị ảnh hưởng bởi các con đường lây nhiễm tương tự đã được xác nhận giữa WSSV và Vibrio spp.

Các quan điểm

Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên kiểm tra sự đồng nhiễm của WSSV và VpAHPND trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong các ao, tôm bị nhiễm WSSV (hoặc mầm bệnh khác) không phải luôn luôn có các dấu hiệu lâm sàng hoặc tỉ lệ chết. Trong những trường hợp đó, ngay cả tôm dương tính với WSSV mà không có bất kỳ triệu chứng lâm sàng nào cũng có thể gây tỉ lệ chết cao hơn và nhanh hơn so với các nhóm tôm tương ứng không mắc bệnh và tôm khó có thể khỏi bệnh sau khi bị lây nhiễm thứ cấp, chẳng hạn như VpAHPND.

Ngoài ra, lây nhiễm thứ cấp sẽ kích thích nhiễm WSSV hoặc sao chép virút, như đã được xác nhận trong nghiên cứu này. Do đó, người nuôi tôm nên chú ý đến việc quản lý nhiều loại bệnh lây nhiễm (bệnh đốm trắng WSSV hoặc các mầm bệnh khác) trong ao của mình để ngăn ngừa thiệt hại thêm trong sản xuất nuôi tôm.

BioAqua.vn

Nguồn: Jee Eun Han, DVM, Ph.D. Ji-Eun Kim, MS Hayun Jo, MS Jong-Su Eun, Ph.D. Chorong Lee, Ph.D. Ji Hyung Kim, Ph.D. Kyeong-Jun Lee, Ph.D. Jae-Won Kim, Ph.D.

Study of co-infection of WSSV and Vibrio parahaemolyticus – Tạp chí Global Aquaculture Alliance tháng 11/2019

 

Chia sẻ

Quay lại