Real-Time PCR cung cấp độ nhạy, độ đặc hiệu trong việc phát hiện plasmid AHPND

Quay lại

Real-Time PCR cung cấp độ nhạy, độ đặc hiệu trong việc phát hiện plasmid AHPND

: 2367

Tóm tắt: Phân tích định lượng bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (qPCR) thời gian thực đã trở thành một sự lựa chọn thay thế hấp dẫn để định lượng mầm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) ở tôm bị nhiễm bệnh. Các tác giả đã triển khai một xét nghiệm qPCR để định lượng plasmid độc tính ẩn náu trong các vi khuẩn gây AHPND. Xét nghiệm này có độ nhạy cao và kết quả có thể thu được trong vòng nửa giờ. Ngoài ra, phương pháp này có thể được sử dụng để định lượng mầm bệnh trong các mẫu nước và mẫu tôm từ các trang trại. Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND), còn được gọi là hội chứng tôm chết sớm (EMS) đã gây ra tỷ lệ chết nghiêm trọng trong quần thể tôm nuôi: tôm thẻ Litopenaeus vannamei và tôm sú Penaeus monodon. Loại bệnh này đã dẫn đến thiệt hại sản xuất và kinh tế đáng kể tại các trang trại nuôi tôm và các ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản nói chung trong các khu vực bị ảnh hưởng.

Kỹ thuật thử nghiệm với độ nhạy cao có thể được sử dụng để định lượng mầm bệnh trong các mẫu nước và mẫu tôm.

Các dấu hiệu lâm sàng ở tôm bị nhiễm bệnh là đường tiêu hóa rỗng và hơi trắng, dạ dày và gan tụy teo. Tác nhân gây bệnh được xác định là các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus duy nhất có chứa các gen độc tố tương tự pirA và pirB. Những gen này đều nằm trong một plasmid lớn kích thước 69 kb. Các plasmid tự sao chép, các phân tử ADN sợi kép đi qua giữa các tế bào vi khuẩn nhờ quá trình tiếp hợp và biến nạp.

Ban đầu, chẩn đoán AHPND chỉ có thể thực hiện được nhờ các kiểm tra mô học và thử nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm.

Sau đó, các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên phản ứng chuỗi polymerase truyền thống xét nghiệm nhắm vào các gen tương tự pirA và/hoặc pirB bắt đầu sẵn có. Tuy nhiên, định lượng mầm bệnh AHPND ở các động vật bị nhiễm bệnh là một trong những phương tiện quan trọng nhất để theo dõi tiến triển của bệnh.

Số lượng vi khuẩn có thể được xác định nhờ đếm khuẩn lạc (CFU), nhưng đây là một phương pháp tỉ mỉ và mất thời gian. Phân tích định lượng phản ứng chuỗi polymerase (qPCR) thời gian thực đã trở thành một lựa chọn thay thế hấp dẫn nhờ lợi thế về tốc độ, độ nhạy và độ đặc hiệu.

Mồi PCR, mẫu dò

Các mồi PCR và mẫu dò thủy giải tăng cường độ đặc hiệu để phát hiện plasmid độc tính đã được chọn lọc từ gen tương tự PirA. Các mồi được sử dụng để khuếch đại một đoạn ADN dài 135-bp. Mẫu dò đã được tổng hợp và dán nhãn với màu nhuộm khác nhau ở 1 trong 2 đầu.

Các mẫu ADN chiết xuất đã được cho vào một hỗn hợp qPCR chứa 0,3μ mỗi đoạn mồi và 0,1 μ mẫu dò để có thể tích cuối cùng là 10 μL. Chương trình phản ứng qPCR gồm ở 95 °C trong 20 giây, sau đó là 40 chu kỳ ở 95 °C trong 3 giây và ở 60 °C trong 30 giây.

Độ nhạy, độ đặc hiệu

Giới hạn phát hiện của xét nghiệm qPCR này ít hơn 10 bản sao plasmid độc tính.

Đường chuẩn (102-108 bản sao plasmid) được thể hiện trong hình 1. Phương pháp này có thể phát hiện 12 phân lập V. parahaemolyticus gây AHPND từ Mexico và Việt Nam, nhưng đã không phản ứng chéo với 35 chủng vi khuẩn Vibrio không gây bệnh.

Hình 1. Đường chuẩn và điện di trên gel của xét nghiệm qPCR AHPND. Hình nhỏ bên trong: Điện di trên gel của các sản phẩm khuếch đại từ qPCR.

Ảnh hưởng đến tôm nuôi

Các tác giả đã sử dụng 2 trường hợp của trang trại nuôi tôm thẻ chân trắng L. vannamei thu mẫu vào năm 2012 để phát hiện và định lượng plasmid AHPND.

Trường hợp 1 gồm 32 tôm ấu niên được thu mẫu từ Trung Quốc đã cho thấy tỷ lệ chết đáng kể và ảnh hưởng AHPND nặng nề, được xác định qua kiểm tra mô học. Bằng kỹ thuật qPCR, ADN chiết xuất từ ​​mỗi cá thể tôm được chứng minh dương tính với AHPND.

Số lượng plasmid độc tính dao động từ 2,5 x 103 đến 4,7 x 106 bản sao trên mỗi miligam mô (Bảng 1).

Trường hợp thứ 2 bao gồm 12 tôm ấu niên từ tỉnh Bến Tre của Việt Nam. Những con tôm này bị tỉ lệ chết cao và sau đó đã nhận thấy nhiễm AHPND qua kiểm tra mô học. Trong phân tích qPCR, DNA chiết xuất từ ​​các mô gan tụy đã chứng minh 5 trong số 12 con tôm này dương tính với AHPND. Số lượng plasmid độc tính là 3,9 – 5,8 x 105 bản sao trên mỗi miligam mô.

Plasmid độc tính sao chép số lượng khác nhau, dao động từ 4 đến 105-6/mg mô. Như vậy, lượng vi khuẩn AHPND trong tôm bị nhiễm sẽ được dự kiến ​​cũng biến thiên cao. Điều này cho thấy các yếu tố khác ngoài lượng vi khuẩn, chẳng hạn như số ngày tuổi của tôm hoặc kích cỡ, sự hiện diện của mầm bệnh khác hoặc các điều kiện môi trường có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ chết ở các trang trại bị tác động.

Tôm nhiễm bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm

Tôm lấy từ quá trình lây nhiễm trong phòng thí nghiệm được phân tích tìm AHPND. Ở thử nghiệm sinh học thứ 1, thử nghiệm cho ăn qua đường miệng, tôm thẻ L. vannamei sạch bệnh có trọng lượng cá thể trung bình là 1 g được cho ăn thức ăn tôm trộn với V. parahaemolyticus AHPND. Vi khuẩn ban đầu cho sinh trưởng đạt đến 1 x 109 CFU/mL và trộn với thức ăn tôm theo tỉ lệ 1:1.

Tất cả 50 cá thể tôm bị nhiễm đều sắp chết hoặc chết trong vòng 2 ngày. Số tôm này dương tính với AHPND qua kiểm tra mô học và qPCR. Số lượng plasmid độc lực dao động từ 2,5 x 103 đến 4,7 x 106 trên mỗi miligam mô (Bảng 1).

Trong thử nghiệm sinh học thứ 2, tôm cho phơi nhiễm với V. parahaemolyticus AHPND bằng cách ngâm ở nồng độ 2 x 105 CFU/mL nước. Tất cả tôm đã chết trong vòng hai ngày. Bằng kỹ thuật qPCR, số lượng plasmid độc tính ở tôm sắp chết/chết dao động từ 1,8 x 103 đến 7,9 x 105 bản sao trên mỗi miligam mô (Bảng 1).

Bảng 1. Số lượng plasmid có trong các mẫu tôm và mẫu nước cho lây nhiễm trong điều kiện phòng thí nghiệm

Thử nghiệm sinh học thứ 3 là một thí nghiệm cảm nhiễm với một dòng tôm thẻ L. vannamei được chọn lọc. Ở trọng lượng trung bình là 2 g, tôm được thả nuôi trong bể 1000-L và cho thức ăn có V. parahaemolyticus AHPND. Vào ngày thứ 9, 244 tôm (48%) sống sót, trong khi không con còn tôm nào trong số 50 con ở bể đối chứng dương sống sót sau 2 ngày.

Kiểm tra mô học đã không phát hiện AHPND trong những con tôm còn sống. Bằng qPCR, số lượng plasmid AHPND là 18 – 390 bản sao/mô mg (Bảng 1), cho thấy dòng tôm chọn lọc này chống đỡ lại bệnh tốt hơn. Tuy nhiên, những con tôm còn sống sót có số lượng vi khuẩn gây bệnh ít có thể hoạt động như là vectơ/vật mang mầm bệnh có khả năng lan truyền bệnh.

Mặc dù mô gan tụy thường được lấy mẫu để phát hiện V. parahaemolyticus AHPND, nhưng thử nghiệm sinh học thứ 4 đã được thực hiện để chứng minh các mẫu nước có thể được sử dụng để chẩn đoán AHPND.

Trong thử nghiệm sinh học này, tôm cho ăn thức ăn trộn với V. parahaemolyticus AHPND, nước được lấy mẫu từ mỗi bể vào ngày thứ 5 và cô đặc gấp 50 lần. AHPND đã được phát hiện ở 7 trong số 9 mẫu nước bằng kỹ thuật qPCR có độ nhạy cao, dao động 3,5 x 102 – 2,2 x 106 bản sao plasmid/mL nước (Bảng 1). Điều này là xác đáng do AHPND đã được báo cáo là có thể được truyền qua nước từ các ao đã bị ảnh hưởng AHPND.

BioAqua.vn

Nguồn: Jee Eun Han, DVM, Ph.D., School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, University of Arizona Tucson, Arizona 85721 USA, jeehan@email.arizona.edu; Kathy Tang, Ph.D.; Carlos Pantoja, Ph.D.; Brenda White; Donald Lightner, Ph.D., School of Animal and Comparative, Biomedical Sciences University of Arizona.

Chia sẻ

Quay lại