Định danh và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn được phân lập từ các chế phẩm sinh học/men vi sinh sử dụng trong nuôi tôm ở Việt Nam

Tóm tắt nghiên cứu

Liên quan đến việc gia tăng sử dụng chế phẩm sinh học/probiotic trong nuôi tôm và các loại thủy sản khác, mục tiêu của nghiên cứu này là để xác định thành phần các loài vi khuẩn trong các chế phẩm sinh học/men vi sinh thường được sử dụng trong nuôi tôm ở Việt Nam. Hơn nữa, độ nhạy cảm kháng khuẩn kiểu hình và cơ sở di truyền về kháng kháng khuẩn ở các chủng/dòng vi khuẩn có lợi đã phân lập được xác định để đánh giá khả năng chuyển giao kháng kháng sinh.

Tóm tắt: Probiotic/Chế phẩm sinh học đang ngày càng được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản để kiểm soát bệnh, cải thiện tiêu hóa thức ăn và chất lượng nước ao nuôi; tuy nhiên, ít người biết về các đặc tính kháng kháng khuẩn của các loài vi khuẩn có lợi probiotic như vậy và đến mức độ nào chúng có thể góp phần vào sự phát triển kháng khuẩn trong các ao nuôi trồng thủy sản.

Những mối quan ngại dấy lên về thông tin công bố trên nhãn sản phẩm probiotic (men vi sinh) không chính xác và thông tin về thành phần vi khuẩn thường bỏ sót. Do đó, chúng tôi đã đánh giá 7 chế phẩm sinh học/men vi sinh thông thường được sử dụng trong nuôi tôm ở Việt Nam về thành phần các loài vi khuẩn, đề kháng kháng khuẩn kiểu hình và kết hợp các gen kháng có thể chuyển. … 13 loài vi khuẩn công bố trên các chế phẩm sinh học không thể xác định được và 11 loài Bacillus không công bố đã được xác định. Chỉ 6/60 mẫu phân lập kháng với hơn 4 loại kháng sinh và toàn bộ trình tự gen cho thấy chúng đã chứa các gen kháng macrolide (ermD), tetracycline (tetL), phenicol (fexA) và trimethoprim (dfrD, dfrG và dfrK), nhưng không có các cấu trúc đã biết liên quan đến sự chuyển gen ngang. … Quy trình thủ tục phê chuẩn chế phẩm sinh học phải được củng cố thông qua các thử nghiệm hiệu quả trên cơ sở khoa học và nhãn sản phẩm nên cho phép xác định các chủng vi khuẩn riêng và thông báo cho nông dân về mục đích cụ thể, liều dùng và các biện pháp áp dụng đúng cách.

Một nhà nghiên cứu đã báo cáo 19% các trang trại nuôi tôm thâm canh ở Việt Nam sử dụng oxytetracycline, ciprofloxacin và/hoặc enrofloxacin chủ yếu để điều trị hội chứng tôm chết sớm (EMS), còn được gọi là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS). Sự phổ biến sử dụng men vi sinh/probiotic trong nuôi tôm đã phát triển trên toàn thế giới, chủ yếu là vì nông dân thường cảm thấy tác dụng hạn chế của điều trị kháng sinh, mà còn vì các vấn đề và các báo cáo liên tục phát hiện dư lượng kháng sinh trong tôm xuất khẩu. Các chủng vi khuẩn có lợi/probiotic được quan niệm là ức chế mầm bệnh bằng cách chiếm đóng môi trường đường ruột và để sản xuất các hợp chất có tác dụng diệt sinh các mầm bệnh tôm. Hơn nữa, vi khuẩn có lợi cho vào thức ăn nuôi tôm có thể tăng cường sự hấp thu các chất dinh dưỡng khác nhau và tăng năng suất. Sự phổ biến sử dụng chế phẩm sinh học được đánh dấu bởi một nghiên cứu gần đây cho thấy 91% số người nuôi tôm được khảo sát đã sử dụng chế phẩm sinh học. Trong số đó, 84% sử dụng men vi sinh/chế phẩm sinh học trực tiếp vào nước ao để cải thiện chất lượng nước, giảm stress môi trường, và 16% trong số họ trộn men vi sinh/men tiêu hóa với thức ăn viên. Một nhà nghiên cứu đã cho biết vi khuẩn Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis và Lactobacillus acidophilus là những loài vi khuẩn chính có trong các chế phẩm sinh học được sử dụng bởi người nuôi tôm Việt Nam. Thành phần loài vi khuẩn và hàm lượng bình thường được liệt kê trên nhãn sản phẩm. Người nuôi tôm, tuy nhiên, nói chung không biết chắc về tác động của nhiều loại men vi sinh/chế phẩm sinh học khác nhau.

Ngược lại với kháng sinh, men vi sinh thường được tin rằng không đóng vai trò trong sự phát triển đề kháng trong số mầm bệnh vi khuẩn của động vật thủy sinh hoặc quần thể vi khuẩn thủy sinh nói chung. Đề kháng phát triển thông qua áp lực chọn lọc kháng khuẩn có thể lây lan qua các cơ chế khác nhau, ví dụ, chuyển gen ngang qua plasmid và các yếu tố di truyền khác. Các chủng vi khuẩn probiotic sử dụng trong chăn nuôi thực sự đã phát hiện có chứa gen kháng tetracycline. Ngoài ra, sự hiện diện và biểu hiện của các gen kháng nằm trên plasmid và transposon (gen nhảy) ở các loài Lactobacillus và các loài Bacillus được sử dụng làm chế phẩm sinh học trong thực phẩm đã được báo cáo. Trong hướng dẫn gần đây được cung cấp bởi cơ quan phê duyệt việc sử dụng kháng sinh đã tuyên bố rõ ràng về sự hiện diện của kháng kháng sinh trong các chủng vi khuẩn có lợi/probiotic là không được phép. Hơn nữa, thành phần các loài vi khuẩn và hiệu quả có lợi có thể đo lường được và các cơ chế liên quan giải thích cho các tác động như vậy dường như thường không có tài liệu đối với nhiều chế phẩm sinh học/men vi sinh bán trên thị trường.

Bảy chế phẩm sinh học/men vi sinh thông thường được sử dụng trong nuôi tôm Việt Nam đã được mua từ cửa hàng hóa chất nuôi trồng thủy sản tại các tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu ở đồng bằng sông Cửu Long. 3 trong số các chế phẩm sinh học này đã được tiếp thị là thức ăn bổ sung và 4 sản phẩm cho xử lý nước. Bốn chế phẩm sinh học ở dạng bột và ba là dạng viên. Hai sản phẩm probiotic đã được nhập khẩu và phân phối bởi các công ty Việt Nam trong khi các sản phẩm còn lại được sản xuất và phân phối bởi các công ty địa phương. Thông tin trên các nhãn sản phẩm mô tả về nội dung và công thức, các giống và loài vi khuẩn, nồng độ của chúng, ngày hết hạn và kết quả mong đợi. Sau khi mua hàng, các chế phẩm sinh học được bảo quản ở nhiệt độ phòng và được vận chuyển đến trường Đại học Copenhagen, Đan Mạch, để phân tích vi khuẩn. Các sản phẩm đã được phân tích ít nhất là một năm trước ngày ghi hết hạn.

Căn cứ trên nhãn của 7 sản phẩm, các loài vi khuẩn sau đây đã được tìm thấy: Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. megaterium, B. laterrosporus, B. amyloliquefaciens, B. thuringiensis, B. mesentericus, B. circulans, B. azotoformans, B. pantothenticus, B. coagulans, Lactobacillus acidophilus, Pediococcus acidilactici, L. helveticus, L. lactic, L. sporogenes, loài Nitrobacter, loài Nitrosomonas, Alcaligenes denitrificans và Pseudomonas denitrificans. Phân tích vi sinh vật đã được thực hiện để định danh các loài vi khuẩn, không phải để xác định nồng độ của riêng từng chủng vi khuẩn có lợi/probiotic.

Như các loài Bacillus cho đến nay là các loài vi khuẩn được công bố và phân lập phổ biến nhất, 6 đại diện phân lập bao gồm B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. tequilensis, B. cereus, B. Aerius và B. nealsonii đã được lựa chọn phân tích toàn bộ trình tự gen để xác định các gen kháng kháng sinh. Các phân lập được lựa chọn dựa trên đa mẫu kháng kháng sinh của chúng chủ yếu với kháng sinh được sử dụng trong điều trị ở người, ví dụ, ciprofloxacin, tetracycline, sulfamethoxazole/trimethoprim, erythromycin và clindamycin.

Nhìn chung, chúng tôi không thể phân lập tất cả các loài vi khuẩn được công bố trong các chế phẩm sinh học. Các loài vi khuẩn được xác định, nhưng không được công bố bao gồm một số loài vi khuẩn Bacillus, Aerococcus urinaeequi và loài Klebsiella. Tổng cộng có 15 loài Bacillus đã được xác định so với 11 loài công bố. Tuy nhiên, chỉ có 4 trong số 11 loài công bố được phân lập.

Tổng cộng 65 phân lập được chọn để thử nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh bao gồm các loài Bacillus (60), loài Klebsiella (4) và Aerococcus urinaeequi (1). Nói chung, những chủng của loài Bacillus nhạy cảm với một phạm vi rộng của các kháng sinh được thử nghiệm, ví dụ, 9 trong 60 (15%) là hoàn toàn nhạy với tất cả kháng sinh được thử nghiệm. Mười hai (20%) chủng của loài Bacillus kháng với hơn 3 loại kháng sinh.

Ba chủng loài Klebsiella đều chỉ kháng với ampicillin, trong khi chủng Aerococcus urinaeequi đã cho thấy kháng với ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, oxacillin, penicillin và sulfamethoxazole/trimethoprim.

Trong nghiên cứu hiện nay, 125 chủng vi khuẩn được phân lập và xác định từ 7 chế phẩm sinh học thương mại đã lựa chọn thông thường được sử dụng trong nuôi tôm Việt Nam. Các sản phẩm bao gồm 118 chủng Bacillus, 6 chủng Klebsiella và 1 chủng Aerococcus urinaeequi. Tất cả 7 chế phẩm sinh học chứa các chủng vi khuẩn không được công bố trên nhãn sản phẩm; tổng số 11 loài Bacillus đã xác định không được công bố. Hơn nữa, 7 loài Bacillus đã công bố không thể phân lập. Ngoài ra, các loài Lactobacillus đã được công bố đối với một số sản phẩm và Pseudomonas denitrificans đã được liệt kê trong một sản phẩm khác; tuy nhiên, không có loài nào trong số các loài vi khuẩn này xác định được có trong sản phẩm.

Chúng tôi đôi khi chỉ có thể phân lập ít hơn 5 cụm khuẩn lạc của mỗi loại được nhìn thấy trên môi trường cấy riêng mặc dù thực hiện cấy truyền từ độ pha loãng thấp nhất của sản phẩm, cho thấy nồng độ của các chủng vi khuẩn có lợi/probiotic thấp hơn công bố. Mặc dù chúng tôi nhận thấy việc này không đại diện cho một khuynh hướng chính về sự đa dạng của các loài được xác định, có thể là một số loài đã công bố thực sự có trong sản phẩm, nhưng không xác định được, do các loài khác nhau thể hiện hình thái khuẩn lạc giống hệt nhau.

Cần lưu ý chúng tôi đã không xác định bất kỳ loài Vibrio nào, ví dụ như V. parahaemolyticus, có liên quan đến hội chứng tôm chết sớm (EMS). Bởi vì việc sản xuất các hợp chất có lợi khác nhau và các đặc tính tích cực khác của vi khuẩn có lợi/probiotic khá đặc hiệu theo dòng và các đặc tính như vậy có thể khác nhau đáng kể giữa các dòng/chủng của cùng các loài vi khuẩn, các nhãn sản phẩm nên nêu chính xác các loài vi khuẩn có trong đó. Tuy nhiên, thông tin chi tiết về các chủng thực tế, ví dụ, số định danh duy nhất, cũng nên cung cấp cho phép người sử dụng và những người liên quan khác để có được thông tin cụ thể về các chủng cụ thể được sử dụng. Không sản phẩm nào trong số được phân tích này cung cấp thông tin cho phép xác định các chủng vi khuẩn có lợi/probiotic cụ thể được sử dụng.

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam (Bộ NN & PTNT), các chế phẩm sinh học được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản phải đăng ký trước khi được bán cho người nuôi tôm. Tổng cục Thủy sản thuộc Bộ NN & PTNT có trách nhiệm phê duyệt chính thức các chế phẩm sinh học/probiotic để sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Sự phê chuẩn như vậy căn cứ trên hiệu suất được viết thành văn bản qua khảo nghiệm tại ao nuôi, phân tích thành phần các loài vi khuẩn và nồng độ được thực hiện bởi các phòng thí nghiệm đã được phê duyệt bởi Bộ NN & PTNT, việc đánh giá các thông tin được cung cấp trên các nhãn sản phẩm và thanh tra tại chỗ các cơ sở sản xuất và bảo quản tại nhà sản xuất.

Tất cả 7 chế phẩm sinh học được phân tích trong nghiên cứu này nằm trong danh mục các sản phẩm đã được phê duyệt. Cần lưu ý tổng số sản phẩm đã đăng ký để sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam trong năm 2012 là 2.913, trong đó có 813 sản phẩm gọi là thuốc thú y và 2.100 hóa chất bao gồm cả chế phẩm sinh học. Rõ ràng, việc phê duyệt số lượng lớn sản phẩm đã đăng ký như vậy sẽ đòi hỏi các nguồn lực khổng lồ và cực kỳ tốn kém. Chúng tôi không biết nếu thông tin không đầy đủ được cung cấp về các loài vi khuẩn có trong sản phẩm và công bố trong các sản phẩm được thử nghiệm trong nghiên cứu của chúng tôi có thể là do kiểm tra không đầy đủ trước khi sản phẩm được phê duyệt hoặc nếu thành phần các loài vi khuẩn có thể đã được thay đổi sau khi sản phẩm đã phê duyệt.

Ngoài ra, có vẻ như một công ty muốn tiếp thị một chế phẩm sinh học mới với thành phần loài vi khuẩn và hàm lượng giống hệt với một sản phẩm đã được phê duyệt không cần chứng minh tác động khả quan trong khảo nghiệm tại ao trước khi được đưa ra thị trường. Quan sát của chúng tôi về các nhãn sản phẩm cho thấy chỉ có 2 sản phẩm đã cung cấp thông tin về cách thức sản phẩm cần được xử lý thế nào khi trộn với thức ăn. Thông tin được cung cấp trên một số nhãn không rõ ràng và dường như phóng đại hiệu quả của sản phẩm, ví dụ, một sản phẩm công bố rằng có thể làm tăng mức oxy.

Hầu hết các vi sinh vật trong chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản là các loài Bacillus, Lactobacillus và nấm men, mặc dù các loài vi khuẩn khác như loài Nitrosomonas cũng có thể có. Chúng tôi đã xác định tổng số 15 loài Bacillus trong 7 sản phẩm được kiểm tra và các loài Bacillus, bao gồm B. clausii, B. licheniformis, B. cereus, B. pumilus và B. thuringiensis, thường có trong các chế phẩm sinh học vì chúng được báo cáo để sản xuất các hợp chất kháng sinh ức chế mầm bệnh và kích thích hệ miễn dịch. Quan trọng không kém là các loài Bacillus có thể được giữ ở dạng bào tử và do đó được bảo quản ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong thời gian dài. Các vấn đề về định danh sai và ghi nhãn các loài Bacillus đã mô tả trong nghiên cứu này được chứng minh bởi các nhà nghiên cứu khác khi phát hiện thấy loài Bacillus được sử dụng làm liệu pháp vi sinh qua đường uống và phòng ngừa viêm dạ dày ruột đã bị nhầm là B. subtilis. Các nhà nghiên cứu đã báo cáo hơn 28% sản phẩm nuôi cấy thương mại dành sử dụng là chế phẩm sinh học cho con người và/hoặc động vật bị định danh nhầm ở cấp độ giống và loài.

Một số loài Bacillus được sử dụng phổ biến đã thể hiện đề kháng kháng sinh như chloramphenicol, tetracycline, erythromycin, lincomycin, penicillin và streptomycin.

Kết luận: Tất cả 7 chế phẩm sinh học đã được phê chuẩn của cơ quan quản lý Việt Nam, nhưng vẫn có các chủng vi khuẩn không được công bố trên nhãn sản phẩm, và tổng số 11 loài Bacillus đã xác định không được công bố. Hơn nữa, các loài Bacillus và các loài vi khuẩn khác đã công bố không thể phân lập được. Mặc dù quá trình phân lập và định danh dựa trên nuôi cấy của chúng tôi có thể đã bỏ sót một vài loài vi khuẩn có trong sản phẩm được thử nghiệm này, điều này sẽ thể hiện xu hướng thiểu số, nhưng các nghiên cứu trong tương lai có thể áp dụng phương pháp định danh độc lập nuôi cấy như giải trình tự ADN pyrosequencing. Thông tin nhãn chế phẩm sinh học nên hướng dẫn cách sử dụng và liều lượng chính xác, cũng như cho phép định danh riêng từng chủng vi khuẩn hơn là chỉ công bố về các loài vi khuẩn. Việc phê duyệt các chế phẩm sinh học cần được củng cố và nên có các tài liệu từ các thử nghiệm hiệu quả dựa trên căn cứ khoa học và không có kháng kháng sinh trong các chủng vi khuẩn có lợi. Nhìn chung, các loài Bacillus cho thấy kiểu hình kháng kháng sinh hạn chế. Toàn bộ trình tự gen của đa loài Bacillus kháng kháng sinh được lựa chọn cho thấy chúng chứa một số lượng ít các gen kháng với macrolides, tetracycline, phenicol và trimethoprim, nhưng không phải cấu trúc di truyền bất kỳ nào liên quan đến chuyển gen ngang. Tham khảo bảng xếp hạng đề nghị gần đây về những nguy cơ sức khỏe cộng đồng liên quan đến các gen kháng kháng sinh được tìm thấy trong các nghiên cứu metagenomic, các gen được tìm thấy trong nghiên cứu của chúng tôi có thể được xếp vào nguy cơ thấp nhất. So sánh với các loài vi khuẩn có trong thiên nhiên ở môi trường nuôi trồng thủy sản, tài liệu nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các chủng vi khuẩn có lợi được sử dụng trong nuôi tôm Việt Nam có các loại và số lượng gen kháng rất hạn chế.

BioAqua.vn

Nguồn: PLOS ONE.  Identification and Antimicrobial Resistance of Bacteria Isolated From Probiotic Products Used in Shrimp Culture.  Gazi Md. Noor Uddin, Marianne Halberg Larsen, Henrik Christensen, Frank M. Aarestrup, Tran Minh Phu, Anders Dalsgaard (email adal@sund.ku.dk, Department of Veterinary Disease Biology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark).  July 6, 2015.